(复旦大学附属上海市公共卫生临床中心感染控制科，上海)

作者：吴文娟张友祥卢洪洲

关键词：真菌定植感染诊断

中图分类号：R

文献标识码：A

文章编号：．（）05-．03

诊断学理论与实践年第8卷第5期专家论坛

迄今为止，人们发现了大约万种真菌，其中约有余种与人类有关，可成为病原菌或共生菌。其中最常见的有假丝酵母属的白假丝酵母、热带假丝酵母、近平滑假丝酵母、克柔假丝酵母、季也蒙假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、乳酒假丝酵母、都柏林假丝酵母和光滑假丝酵母以及曲霉菌等，它们既可作为正常菌群，也可引起浅表和系统性真菌感染[1]。

目前，人们对人类真菌微生态环境仍不十分清楚，如真菌感染患者中有多少真菌克隆(基因型/表型)、真菌在感染和定植等不同状态如何与宿主相互作用及如何鉴别等。区分真菌的定植与感染非常困难，这导致医师对真菌感染的诊断和治疗存在很多困惑。

真菌定植与感染的基础

真菌定植是指在人体与外界相通的部位，如消化道、上呼吸道、泌尿生殖道等部位有大量呈孢子状态生长的真菌而并未损伤局部组织或出现症状。定植可以是真菌和宿主之间建立长期持续的共生关系或是无害关系的最后一步，其可转化为真菌感染和疾病发生、发展的第一步。共生或致病取决于宿主和微生物的特性，但均依赖于真菌首先成功定植在宿主组织表面。

感染是指真菌在人体内或体表生长繁殖引起的机体损害，损害的范围和严重性由很多因素决定，如真菌的致病力、感染数量和部位及宿主健康状况等，当感染引起宿主一个或多个器官生理功能的显著改变时则会产生疾病。人体的正常菌群中可存在少量的真菌，主要是假丝酵母菌属[2]。

正常菌群中有暂居菌和定植菌，前者仅在宿主细胞表面存活但不繁殖，常从细胞表面脱落。决定微生物能否在宿主中定植的条件有：一是真菌必须先识别宿主细胞相应的受体，与细胞发生作用而黏附于细胞上；二是黏附后的真菌进一步改变宿主环境而实现稳定黏附(即定植)。定植在正常情况下并不导致健康宿主组织病变，不同于感染，因为后者是指微生物在体内长期停留而引起的病变，如烟曲霉和接合菌属可引起肺部感染；担子菌纲真菌新生隐球菌新生亚种和gattii亚种可感染肺和中枢神经系统；一些双相性真菌如组织胞浆菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌、马内菲青霉和申克孢子丝菌等可引起人类疾病。

其他与人类疾病相关的常见真菌还有马拉色菌属，通常共生于人体皮肤和分泌物中，其分泌的抗原蛋白可直接引起皮肤疾病，对人类致病的真菌还有可引起皮肤、指甲及头发感染的皮肤癣菌和毛霉目、镰刀菌和足放线病菌属以及黑曲霉等[1]。

条件致病真菌广泛存在于自然界的土壤、水、空气及人体各部位，如口咽部、肠道、泌尿生殖道或皮肤等处，这些真菌毒力低，一般不具有致病性。条件致病真菌在人体内的异常定植和增殖是引起内源性感染的关键环节。导致人体内条件致病真菌异常增殖的因素有：严重创伤或感染、慢性消耗性疾病、先天性免疫缺陷和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、长期使用广谱抗菌药物、长期使用糖皮质激素或免疫抑制剂、长期留置导管或放置静脉插管等[3]。

同时，研究发现真菌并不只对免疫力低下或其他虚弱的宿主致病，许多真菌感染可发生在健康人群，包括真菌性鼻窦炎和阴道炎，并且可能与哮喘、过敏和有害建筑综合征有关，甚至播散性隐球菌病也可在无基础疾病和生理紊乱的宿主体内发生。

真菌感染的实验诊断方法

真菌感染的准确、早期诊断是治疗疾病和抢救生命的关键。然而，目前真菌的诊断技术尚不能满足需求，目前用于真菌性疾病检测的方法有传统的直接涂片镜检、真菌培养和一些新的非培养快速诊断技术。显微镜检查真菌的阳性率较低，而且无法确定菌种；真菌分离培养所需的时间长，敏感度也不高。

非培养快速诊断技术主要有以下4类：

①半乳甘露聚糖(GM)浓度测定，其对曲霉菌感染诊断具有很高的特异性。8年欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组(EORTC/MSG)将其纳入侵袭性真菌病诊断标准。但GM试验结果可受到真菌感染部位、真菌释放GM的量、使用抗真菌药和某些抗菌药以及某些食物等因素的影响，使用哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸的患者也可能出现假阳性[4]。

②（1,3）-β-D葡聚糖(G试验)能够对侵袭性真菌感染作出早期诊断，但其不能检测隐球菌和接合菌，也不能鉴定具体菌种。国外研究显示G试验用于血液、支气管肺泡灌洗液、脑脊液的检测，其灵敏度为67％～％，特异度为90％，连续2次阳性时特异度增至96％，阴性预测值为％。正常人群血液中G浓度一般小于10pg/mL，均值一般为2.7pg/mL，而真菌感染患者则浓度一般大于20pg/mL[5]。然而，截至年9月，G试验并未在国内做过大样本的人群调查，不同仪器、不同试剂的正常参考范围不能照搬国外标准，而且体液中的蛋白酶可干扰检测结果，输注白蛋白或球蛋白、血液透析、输注抗肿瘤的多糖类药物等情况下可出现假阳性，故临床对结果的判断需要考虑多方因素。

③抗原抗体检测可用于如隐球菌病的诊断，胶乳凝集试验可直接检测血清、脑脊液中隐球菌抗原。检测体液中的巴西副球孢子菌抗原，可用于副球孢子菌病的诊断和随访。特异性抗体检测可用于诊断地方性真菌病，例如芽生菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病、副球孢子菌病和青霉病。

④分子诊断方法，聚合酶链反应(PCR)方法用于诊断真菌感染是近期研究的热点。可通过扩增和检测特异性的DNA序列，用于诊断生长缓慢或难以培养的真菌感染，PCR检测具有高度敏感度及特异度，但目前尚未用于直接诊断真菌感染性疾病(包括假丝酵母引起的血流感染)。

新的诊断方法是使用气相色谱-质谱法鉴定真菌。基于液态芯片和微流体芯片技术的方法也是真菌诊断的另一发展方向，将来可开发一种能诊断多种不同真菌感染的芯片[1]。

真菌定植与感染的鉴别

真菌感染的诊断标准目前尚不统一。Bodey等[6]指出，患者如果出现系统性真菌感染症状和体征(发热、低血压、心动过速等)且至少1次在血培养标本中分离到假丝酵母菌，将确定为假丝酵母菌血症。EORTC/MSG侵袭性真菌病修订定义[4]指出，确诊病例需要在病变组织中检出真菌成分，即：

①在正常无菌部位(黏膜除外)穿刺或活检标本的组织病理学、细胞病理学或直接显微镜检查见到菌丝或黑色酵母样菌，并有组织损害存在或无菌部位、感染部位标本[除外支气管、肺泡灌洗液(BSL)、尿液和头颅窦腔]培养出丝状真菌或黑色酵母可判断为丝状真菌感染；

②在正常无菌部位(黏膜除外)穿刺或活检标本的组织病理学、细胞病理学或直接显微镜检查见酵母。例如隐球菌属见到荚膜芽生酵母，假丝酵母菌属、毛孢子菌、头状丝孢酵母见到假菌丝或真菌丝。或从取自有感染证据的正常无菌部位处的标本培养出酵母或酵母样菌，可确诊为酵母菌病；

③脑脊液隐球菌抗原阳性提示为播散性隐球菌病。

上述标准主要针对无菌部位的侵袭性真菌感染。而呼吸道、消化道、泌尿生殖道等黏膜部位准确的病原学诊断报告成为临床上是否需要进行抗真菌治疗、如何进行抗真菌治疗的十分重要、十分关键的依据，也是当今临床感染病所遭遇的棘手问题。

以呼吸道为例，住院患者口咽部假丝酵母菌分离率达20％～40％，而慢性肺部疾病和长期应用抗菌药物的患者其分离率可达70％。因此支气管-肺假丝酵母菌病的诊断标准一直是讨论的热点。在非中性粒细胞减少患者的纤维支气管镜采样中分离到假丝酵母菌，即使是高浓度的，都被确定为污染或可能污染而被认定没有临床意义[7]。

确诊支气管-肺假丝酵母菌病必须具备病理组织学证据。临床诊断需要具备意识障碍、头颈部肿瘤接受化放疗者(口咽部易有假丝酵母菌重度定植和吸入)、危重患者、机械通气治疗等宿主因素和真菌学证据(涂片、培养、抗原)三方面证据，包括血清G试验阳性、支气管-肺泡灌洗液或支气管内吸引物涂片见到大量菌丝且培养鉴定为假丝酵母菌，同时其他病原体均为阴性。消化道真菌感染的发生率仅次于呼吸道，口腔假丝酵母菌病、食道假丝酵母菌病和真菌性腹泻在长期应用抗菌药物、免疫抑制剂和接受放化疗的患者以及AIDS、糖尿病、重型肝炎、营养不良、老年及慢性病患者中常见。

消化道真菌感染的确诊需结合消化内镜检查，采集有典型感染症状的黏膜组织在显微镜下涂片观察可见大量真菌菌丝或孢子，特别是菌丝的存在表示假丝酵母菌处于致病状态，意义较大，可明确诊断。如只检测到少量孢子应结合临床症状及镜下表现分析，其有可能为口腔的路过菌[8]。对于粪便标本的涂片和培养，笔者认为即便是多次培养出同一真菌或多次涂片镜检出大量真菌孢子或菌丝，也可能为定植状态，必须结合临床表现判断其是否致病。对于真菌性阴道炎或浅表组织真菌病，在感染部位组织中找到真菌，结合流行病史和临床症状即可判断真菌感染，但确诊需要经真菌病原学检查结果证实。总之，对于正常情况下可有真菌存在的部位，鉴别真菌定植和感染的关键在于临床症状是否有与之相应的病理特征。

真菌定植与感染的转化

真菌感染的机制十分复杂，甚至假丝酵母菌属中不同种类真菌的致病过程也不尽相同。以白假丝酵母菌为例，其黏附力强，常在胃肠道、泌尿生殖道黏膜上皮定植，其小分子可穿透正常致密的肠黏膜上皮，但是否发展至感染并出现临床症状则取决于病原体的数量、毒力及宿主的抵抗力。目前，经动物实验证实的白假丝酵母菌的毒力因子有天冬酰氨蛋白酶、细胞表面疏水分子、高水平磷脂酶、表型转换(产生假菌丝和菌丝的能力)以及酵母甘露聚糖[9,10]。毒力因子的高表达可导致白假丝酵母菌从定植状态转化为感染，引起组织病理改变，但其毒力因子表达调控的分子机制尚待深入研究。当应用抗真菌药物治疗后，具有毒力的白假丝酵母被清除，疾病症状可消失，重新恢复正常定植状态[11,12]。

真菌的异常定植，如曲霉在呼吸道的优势生长、白假丝酵母在消化道或生殖道的长期大量定植往往是引起定植部位感染甚至侵入血流而发生真菌血症、全身性真菌感染的重要预警。因此，在未出现临床症状时，实验室仍需向临床医师重点提示以下几个方面的病原学信息：①标本涂片染色见大量真菌孢子或菌丝；②其他正常菌群消失或减少，真菌数量多且菌落比较纯；③不同日期的标本培养均分离出同一种真菌或某一种真菌呈现持续增多的状况。对于以上情况，临床应结合实验室结果、密切观察病情变化，做到早发现、早治疗或抢先治疗。

迄今，人们对微生物在人体健康中的作用了解不多，真菌在其中的作用更是知之甚少。进行不同条件下的人体真菌微生态调查，可大大提高人们对真菌影响人类健康及其疾病的认识。微生态不平衡可引起疾病，单一的病原菌通常不致病，而是整体菌群致病，宿主的反应决定后果。真菌如何与宿主发生作用关系，细菌、真菌和宿主的平衡如何被打破而发生感染，仍是需要今后研究和解答的问题。

[1]MerryB．TheFungalKingdom：diverseandessentialrolesinearth’secosystem．AReportFromtheAmericanCollegeofMicrobiology[R]．WashingtonDC：AmericalAcademyofMicrobiology，8．

[2]熊德鑫．现代微生态学[M]．北京：中国科学技术出版社．0：79-83．

[3]何礼贤．支气管肺念珠菌病的诊断和治疗[J]．中华结核和呼吸杂志，，32(5)：-．

[4]DePanwB，WalshTJ，DonnellyJP,eta1．ReviseddefinitionsofinvasivefungaldiseasefromtheEuropeanOrganizationforResearchandTreatmentofCancer/InvasiveFungalInfectionsCooperativeGroupandtheNationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseasesMycosesStudyGroup(EORTC/MSG)ConsensusGroup[J]．ClinInfectDis,8，46(12)：-．

[5]KedzierskaA，KochanP，PietrzykA，eta1．Currentstatusoffungalcellwall







































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