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C9orf72是编码一个预测的鸟嘌呤交换因子的基因，该蛋白产物在溶酶体途径中起作用并可以抑制全身性和神经炎症。C9orf72中的六核苷酸重复扩增是导致肌萎缩性侧索硬化（ALS）和额颞痴呆（FTD）的最常见遗传变异。当C9orf72中的六核苷酸重复扩增时，扩增序列被转录成一个长的重复RNA，RNA聚合酶无法读取识别它，因此使C9orf72表达降低。但是在ALS或FTD患病率高的家庭中，六核苷酸重复扩张的作用表现为外显性不全。这表明遗传或环境因素会改变每个人的患病风险。鉴定疾病的修饰物具有重大的意义，因为它可能是降低患ALS或FTD疾病风险的一种策略，或者是减慢病情发展的一种策略。
前期有研究报道，C9orf72LOF突变小鼠由于C9orf72功能不足，从而导致年龄依赖性炎症，其炎症特征是出现细胞因子风暴和自身免疫，中性粒细胞增多，假性血小板减少，脾肿大及发生神经炎症。C9orf72发生突变的ALS或FTD患者在神经系统诊断之前被诊断出自身免疫性疾病的可能性明显更高。
但是，在相同的遗传背景下，C9orf72LOF突变小鼠的长期存活率却在不同的研究报道中存在差异。在一些研究中，发现C9orf72的一个（+/-）或两个（-/-）等位基因的缺失增加了C9orf72突变小鼠过早死亡的风险，而有的研究却指出C9orf72-/-小鼠的存活率降低，但C9orf72+/?小鼠的存活率没有降低。还有研究报道，突变型小鼠的存活率与对照组之间没有显著性差异。这些发现表明了当C9orf72水平降低时，饲养小鼠的环境可能是小鼠存活率的一个重要调控物。
我们拆解的本篇论文是上一期Nature杂志上David教授团队发表的名为“C9orf72suppressessystemicandneuralinflammationinducedbygutbacteria”（C9orf72能够抑制由肠道细菌引起的全身性和神经炎症）的文章。该文指出C9orf72突变型小鼠发病后，通过广谱抗生素或来自保护性环境小鼠的粪便移植可以降低突变小鼠肠内微生物的负荷从而减轻突变小鼠的炎症反应。该文论证逻辑严密，对大家的实验设计很有借鉴价值，值得拆解。
02主要发现David教授团队发现，刺激性免疫细菌数量减少的环境可以保护C9orf72突变小鼠免于过早死亡和显著地改善它们潜在的全身性炎症和自身免疫，还发现即使在突变型小鼠发病后，通过广谱抗生素或来自保护性环境小鼠的粪便移植可以降低突变小鼠肠内微生物的负荷从而减轻突变小鼠的炎症反应。所以肠道微生物可能是C9orf72突变患者（包括自身免疫和炎症患者）神经系统疾病发作和进展的重要调控因素。表明了我们肠道微生物在大脑健康中起了重要的作用，并且以令人惊讶的方式与神经系统疾病的遗传危险因素相互作用。
研究结果Fig1
发现表型：环境控制着动物的生存，炎症和自身免疫
David教授团队把C9orf72突变小鼠放在两个环境下饲养，分别是哈佛大学和布罗德（Broad）研究所。发现在哈佛饲养的C9orf72突变小鼠C9orf72（+/-）和C9orf72（-/-）与C9orf72（+/+）对照组小鼠相比，过早死亡的风险增加（Fig1b）。相反的是，在Broad研究所中，C9orf72杂合或纯合突变小鼠的存活率与C9orf72（+/+）相比没有显著性差异（Fig1c）。因此C9orf72?/?mice当饲养在哈佛比饲养在Broad研究所时更容易的过早死亡。所以当C9orf72水平降低时，来自环境的信号可能是小鼠寿命的一个重要调控物。
为了验证Broad研究所C9orf72突变小鼠的存活率提高是否与小鼠体内炎症和自我免疫减轻有关，David教授团队分析了这两个机构年龄匹配小鼠的炎症标志物。
发现C9orf72（哈佛）突变小鼠表现出自身免疫和炎性表型，包括细胞因子IL-23，IL-10，IL-22，G-CSF，IL-17a，TNF，IFNγ，IL-1β和IL-12p70显著性增加（Fig1h），脾肿大（Fig1d），中性粒细胞个数增加（Fig1e），血小板减少症（Fig1f）和血浆抗dsDNA抗体活性增加（Fig1g）。
而在Broad研究所中，C9orf72突变小鼠的炎症表型与哈佛突变小鼠相比明显减少。我们在哈佛大学观察到C9orf72-/-和C9orf72+/+小鼠之间的炎症特征存在显著性差异（Fig1d-h），在Broad研究所中，C9orf72-/-和C9orf72+/+小鼠之间的一些炎症特征不具有显著性差异。比如中性粒细胞个数和血小板个数（Fig1e-f）。
但是值得注意的是，仍然有一些指标在C9orf72-/-和C9orf72+/+小鼠之间存在显著性差异，比如像脾肿大（Fig1d）。综上结果说明了，当改善生存环境时，可以改善C9orf72突变小鼠的潜在炎症和自身免疫性疾病。
Fig2
抗生素预防炎症
接下来，David教授团队想看两个环境中的哪些因素导致了上述的表型差异，发现两个研究所的饮食，光照等其它环境因素相似，但是这两个环境的微生物筛查报告存在差异，与Broad研究所小鼠相比，哈佛大学里小鼠的肠道中，鼠诺如病毒，幽门螺杆菌，肺炎巴氏杆菌和毛状毛滴虫更为常见，这些微生物在哈佛大学里不认为是致病菌，它们对健康的小鼠无影响。但是幽门螺杆菌属以前曾被报道过具有免疫刺激特性，所以两个环境下的小鼠肠道菌群的不一样有可能是导致哈佛小鼠过早死亡和炎症表型的原因。
为了探究肠道的微生物是否是导致哈佛C9orf72突变小鼠出现炎症和自我免疫表型的原因，David教授团队饲养了新的一批哈佛小鼠（分别是C9orf72(Harvard)+/+,n=22,C9orf72(Harvard)?/?,n=22)，将小鼠分为两组，一组服用广谱抗生素，一组服用清水。
实验结果发现，抗生素显著地降低了小鼠肠内微生物种群的多样性和丰度（包括幽门螺杆菌），但是没有改变鼠诺如病毒的水平（Fig2b）;清水对照组小鼠肠内的微生物种群与之前相比基本上没有变化（Fig2b）;突变小鼠服用抗生素后，抗生素抑制了突变小鼠炎症和自我免疫的发生，其中突变小鼠与对照小鼠相比，中性粒细胞、血小板细胞、抗体活性、脾脏的大小都没有显著性差异（Fig2c-f）。但是清水治疗的那一组，突变小鼠的炎症表型和自我免疫都没有被改善（Fig2c-f）。
实验结果说明了当C9orf72功能减弱时，肠道微生物促进了C9orf72突变小鼠炎症和自我免疫的发生。由于实验中使用的抗生素在之前被报道对小鼠的健康有影响，所以后期没有办法评估服用抗生素对小鼠存活率及运动行为的影响。
Fig3
粪便移植减轻炎症
为了进一步研究上述表型的差异是否是因为肠道微生物的作用而不是抗生素其它的治疗作用，David教授团队进行了粪便移植试验。饲养了新的一批哈佛小鼠，分别是（C9orf72（哈佛）+/+,C9orf72（哈佛）?/?,)，将小鼠短暂的喂养抗生素和水后（Fig3a），然后检测其表型。
实验结果表明，抗生素一组改善了小鼠的炎症和自我免疫（Fig3b-d），与之前的实验结果一致。然后停止抗生素治疗，对这些小鼠进行粪便移植（Fig3e）。发现来自Broad研究所小鼠的粪便显著的改善了突变小鼠的炎症和自我免疫表型，而来自哈佛小鼠老鼠的粪便却没有改善突变小鼠的炎症和自我免疫表型（Fig3f-h）。
这个结果说明了炎症和自我免疫的改善不单是短暂抗生素的作用。因此这个结果证明了由于炎症和自我免疫疾病导致的C9orf72（哈佛）突变小鼠过早死亡是可以通过治疗来预防的。
Fig4
剖析肠道细菌
为了确定C9orf72（哈佛）突变小鼠肠道的哪些微生物与突变小鼠的表型有关，David教授团队对之前报道的两个促炎环境下（哈佛和johns医院）过早死亡的突变小鼠粪便进行粪便组成分分析，同时也分析了之前报道的一个利于生存环境(jackson实验室和Broad研究所）下小鼠粪便的组成分分析（Fig4i）。
主成分分析(PCA，PrincipalComponentAnalysis)，是一种应用方差分解，能够提取出最大程度反映样品间差异的两个坐标轴，如果对PCN图中主成分挑选，那么pc1将会作为主要特征值出现(方差大)，如果样品的群落组成越相似，则它们在PCA图中的距离越接近。群落差异很大的样品则会远远分开。
结果如（Fig4j）所示，两个促炎环境在PC1坐标度量中离得很近，两个促进生存环境在PC1坐标度量中离得也很近，而促炎环境与促进生存环境在PC1坐标度量中离得远，说明促炎环境与促进生存环境之间的群落组成成分差异很大。
为了进一步研究不同环境之间的差异，又做了α多样性指数、β多样性指数分析，分析结果显示了两个促炎环境与促进生存环境相比，α多样性指数明显降低（Fig4l），然后对β多样性进行了层次聚类分析，（聚类分析是一种根据样本之间的距离或者说是相似性，把越相似、差异越小的样本聚成一类（簇），最后形成多个簇，使同一个簇内部的样本相似度高，不同簇之间差异性高）。层次聚类分析图（Fig4k）表明两个促炎环境中的样本的β多样性与两个利于生存环境不同。
为了说明这些显著的群落结构差异，接着检测了这四种环境的细菌丰度并分析，发现种细菌中有62种（20.6％）细菌的丰度在促炎环境与有利于生存环境之间发生了显著变化（Fig4m）。这个结果与之前发现的幽门螺杆菌在促炎环境下存在而在利于生存的环境下不存在的结果一致。
接下来又分析了接收粪便移植小鼠的肠道菌群组成，β多样性的层次聚类分析显示了接收Broad研究所小鼠粪便移植的哈佛小鼠中的微生物组成与Broad研究所饲养的小鼠的粪便相似，与哈佛饲养的小鼠粪便或与接收哈佛环境小鼠的粪便移植小鼠不同（Fig4n）。
对单个细菌的分析同样支持粪便的移植成功，其中在哈佛环境生长下的小鼠体内的85%的细菌在接收哈佛环境粪便的小鼠中可以检测到；在Broad环境生长下的小鼠体内的75%的细菌在接收Broad环境粪便的小鼠中可以检测到（Fig4o）。
幽门螺杆菌的半定量PCR进一步证实了粪便移植重构了体内的微生物组组成，当突变小鼠接收了Broad研究所小鼠的粪便移植后，便检测不到幽门螺杆菌，而接收了哈佛小鼠的粪便移植，仍然可以检测到幽门螺杆菌（Fig4p）。
Fig5
肠道微生物调节髓样细胞因子
接下来David教授团队探索了不同环境下的粪便成分不同如何改变C9orf72?/?小鼠的细胞因子和自我免疫。使用微生物成分的化学类似物刺激了C9orf72（哈佛）小鼠骨髓来源的巨噬细胞。发现与C9orf72（哈佛）+/+对照巨噬细胞相比，C9orf72（哈佛）+/-和C9orf72（哈佛）-/-骨髓来源的巨噬细胞在细菌脂肽、单链（ss）RNA和ssDNA的刺激下，释放出更高水平的几种促炎细胞因子（Fig5a-c）。
接着探究哈佛饲养的小鼠粪便是否比Broad研究所饲养的小鼠粪便包含更高水平的先天免疫刺激因子。因此，在C9orf72（哈佛）-/-和C9orf72（哈佛）+/+骨髓来源的巨噬细胞中加入了来自两个环境的粪便细菌的标准化浓度。发现C9orf72-/-骨髓巨噬细胞暴露在哈佛小鼠粪便下比暴露在Broad研究所小鼠粪便下产生更高水平的TNF（Fig5d）。此外，连续稀释哈佛小鼠的粪便，发现最低浓度的哈佛小鼠粪便仍然可以导致TNF释放（Fig5d）。
Fig6
环境控制神经炎症
神经炎症是与C9orf72突变导致的ALS和FTD的病理标志，指的是大量的外周免疫细胞浸润在脊髓炎患者的脊髓中。我们使用了全血细胞标记物CD45来标记来自外周血CD45high免疫细胞，与CD45mid驻留小胶质细胞区分开。并且发现浸润细胞存在于C9orf72（Harvard）-/-小鼠脊髓内的局灶性炎症部位（Fig6a）；质谱分析表明浸润在脊髓处的外周CD45highcells大部分是CD11b+Ly6C+Ly6G+CD39?中性粒细胞和CD3e+T细胞。使用抗生素对肠道菌群进行终生抑制可防止浸润性髓样细胞在C9orf72（哈佛）-/-脊髓内积聚（Fig6b-c）。
为了检测C9orf72小鼠体内小胶质细胞的激活状态和肠道微生物是否可以改变小胶质细胞的活化状态，我们检测了dectin1的表达水平，dectin1之前被报道与促炎性小胶质细胞有关。当C9orf72功能降低时，小胶质细胞被激活，而且dectin1和CCR9富集在C9orf72小鼠的小胶质细胞里（Fig6d-f）；使用抗生素处理后，dectin1的表达显著性降低（Fig6d-f）。
上述结果说明，当C9orf72功能降低时，外周免疫细胞可以浸润在脊髓中，造成神经炎症。使用抗生素治疗可以抑制微生物群从而调节免疫细胞浸润和胶质细胞活化。
点评1研究意义1，结果表明了当C9orf72功能下降时，环境（尤其是肠道菌群）通常会成为自身免疫，神经炎症，运动功能障碍和过早死亡发生的有效调节剂。进一步解释了微生物群的差异使某些C9orf72突变患者发展为ALS或FTD，或明显的炎症狼疮等疾病，而有的C9orf72突变者却没有发生炎症等其它疾病。
2，在现实生活中，我们有时无法改变自己的生存环境，但是我们可以通过饮食改变我们体内的微生物群落，善待微生物，它们将回报我们。
2可进一步拓展的研究1，如果要验证这篇文章的观点，未来的关键实验将是在携带C9orf72重复扩增载体易患ALS或FTD的家族中，鉴定保持健康的人和患病的人的肠道菌群之间是否存在差异。
2，因为这篇的主要结论是肠道菌群通常会成为自身免疫，神经炎症，和过早死亡发生的有效调节剂，而之前的很多研究报道，饮食可以改变肠道的菌群组成，将来也可以测试在相同的环境下，不同的饮食是否可以改变C9orf72突变小鼠的菌群组成从而改善炎症及自我免疫表型。
3研究思路、逻辑和方法的可借鉴之处1，这篇文章的标题是C9orf72能够抑制由肠道细菌引起的全身性和神经炎症，肠道细菌和炎症是这几年的研究热点，这篇文章的主要内容讲的是肠道菌群对炎症和自我免疫等疾病的调控作用，但是之前有很多报道肠道菌群对人体健康的影响，所以作者在题目上加了一个基因C9orf72，使题目更加新异，让人想读下去。
2，这篇文章做了大量的实验，分子实验，免疫荧光，生信分析。实验方法多样，而且每种结果都有很多指标数据，既提升了数据的可信度，也提升了数据的丰满度，大家可以参考借鉴。
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