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一种揭示宿主和沙门氏菌隔离策略的人类肠道共培养新型模型
恭烨（研究助理）
本周分享文献是于年2月发表于MBIO的文章，题目为：AnAdvancedHumanIntestinalCocultureModelRevealsCompartmentalizedHostandPathogenStrategiesduringSalmonellaInfection。文章通讯作者是德国维尔兹堡大学的J?rgVogel教授和维尔兹堡医学院的MarcoMetzger教授。在本研究中，研究者们建立了一种新型的3–D人肠道模型，通过此模型可以揭示沙门氏菌感染时，宿主和病原体细胞的相互适应性。
目前对鼠伤寒（S.Typhimurium）破坏宿主和免疫系统所采取的对策的研究主要依靠永生化细胞系或小鼠模型。但是人类肠道沙门氏菌感染引起的机体反应需要肠道粘膜、血管内皮和相关免疫系统细胞之间良好的相互作用。这些复杂的相互作用在人类细胞培养环境中难以模仿。细胞系单一培养忽略了炎症组织内的复杂分工和三维精细结构。此外，影响感染过程的关键细胞成分经常缺失，如外周免疫细胞。同样，从完整的系统水平来看，小鼠是研究沙门氏菌感染的一个重要模型，但在抗微生物免疫和沙门氏菌发病机制方面，啮齿类动物与人类之间存在着巨大的差异。例如，S.Typhimurium在免疫能力强的人体内会引发自限性肠胃炎，但在小鼠体内会引起全身性感染甚至败血症。
在本研究中作者提出了一种新型人体肠屏障模型，这个共培养模型包括内皮和上皮肠屏障以及天然的胶原基质和免疫细胞，使作者能够在S.Typhimurium急性感染期间研究宿主和病原体细胞的相互适应性。
由于肠屏障主要是由上皮层和固有层中的胶原支架构成，其中隐藏着的血管进行营养交换和免疫细胞募集。所以作者将脱细胞的猪小肠粘膜下层（SIS）胶原支架固定到CellCrown中，获得两个分离的腔室(Fig.1A)。上部腔室培养人肠上皮细胞（IEC；Caco-2），并使其成熟为紧密的上皮层。基质的基底外侧表面铺满原代人微血管内皮细胞，下部分离的腔室使用外周血白细胞作为血管免疫系统的代表物。
研究者为了确定模型对感染研究的适用性，用一株表达GFP的S.Typhimurium菌株进行试验，并在组织结构中对其进行追踪。荧光显微镜可见由胶原支架分离的上皮和内皮细胞单层，以及沙门氏菌感染了上皮细胞，而非内皮细胞。流式细胞鉴定结果也表明感染模型中上皮细胞为沙门氏菌阳性细胞，而内皮细胞中无感染细胞。与这些结果一致，基底外侧白细胞无感染指征。这些结果证实了沙门氏菌不能穿过上皮组织。随着时间的推移，沙门氏菌在细胞内复制（荧光信号强），速率与之前2DCaco-2感染模型相当。此外，受侵细胞百分比的增加表明感染在上皮内扩散。尽管S.Typhimurium不能通过上皮屏障，内皮细胞间室还是释放了吞噬细胞诱导剂IL-8对感染作出反应。因此，该组织模型成功地展现了上皮组织对沙门氏菌感染的限制和免疫信号跨越肠道屏障，这些现象与人体病理相似。
之后研究者使用这个新模型去研究S.Typhimurium感染时的宿主免疫重编程。作者使用流式细胞仪分选出沙门氏菌感染的阴/阳性上皮细胞进行dualRNA-seq。为了观察免疫反应跨过肠道屏障，同一模型中的内皮细胞（CD31+），单核细胞（CD14+），和NK细胞（CD56+）也被分选出来，并对他们进行转录组测序。宿主细胞RNA测序后的PCA结果表明样品主要细胞类型以分布而非处理方式。宿主感染沙门氏菌后，宿主基底侧细胞的mRNAs和lncRNAs要高于感染的上皮细胞，这证实了组织结构中的血管成分对顶部感染作出了反应。
接着作者通过四种相互作用的宿主细胞来描述各自反应的性质。尽管沙门氏菌没有到达血管，相较于未感染的样本，内皮细胞，单核细胞和NK细胞都对mRNAs进行了重编码（上调或下调）。其中，内皮细胞上调最多的10种mRNAs包括IL-6，CXCL6和CXCL3L1等前炎症细胞因子和免疫细胞趋化因子，这与其生理功能一致。同样地，单核细胞上调主要促炎趋化因子和系统作用细胞因子的mRNAs，如CXCL5，CXCL3、IL-1和IL-1。NK细胞最多的mRNAs是CXCL8，TNFSF4和IL-1R2。IL-8的产生被认为是内皮细胞、单核细胞和NK细胞反应的共同特征。此外，这三种基底外侧细胞对感染的反应包括数十种lncRNAs的差异表达，这些lncRNAs构成了一类在脊椎动物免疫中具有新兴功能的转录本，qRT-PCR证实了MSC-AS1是内皮细胞和单核细胞免疫激活的共享lncRNA标志物。这些数据表明在肠道沙门氏菌感染时，涉及血管免疫激活的关键细胞的编码和非编码转录组都广泛地重编程了。
然后作者通过dualRNA-seq研究了感染S.Typhimurium的IECs中宿主-病原体的相互适应。将细胞内沙门氏菌转录组与之前记录的人类2D单培养细胞内沙门氏菌的表达数据进行PCA比较，发现其根据单核/巨噬细胞和上皮细胞谱系存在分离。上皮细胞感染时（非单核细胞），沙门氏菌基因优先表达，从基因本体(GO)中发现其与氮化合物代谢相关。因此，这个肠道人体组织感染模型概括了上皮细胞适应沙门氏菌基因表达过程，反驳了上皮内环境驱动沙门氏菌基因表达不依赖于培养中是否存在额外的宿主细胞的理论。
上皮细胞中的沙门氏菌上调了SPI2基因（与胞内存活相关），下调了SPI1基因（细胞侵袭相关），同样的SPI2相关T3SS基因（分泌效应蛋白操纵宿主细胞）也上调了。此外，两个PhoP激活相关的sRNAs，PinT和AmgR表达提高；铁缺乏激活的sRNAs同源物RyhB和IsrE也大量表达。这些结果与之前在2D单培养模型中观察到的沙门氏菌毒力基因表达模式一致，并反映了沙门氏菌细胞内环境的适应性。
接下研究者开始寻找被感染的IECs中由病原体引起的改变。GFP阳性与阴性上皮细胞中都诱导了TNF和NOD样受体先天免疫信号通路相关基因。沙门氏菌感染的IECs还特异性激活JAK/STAT3相关基因，包括SOCS3，FGA和FGB（免疫和损伤修复相关基因）。WB分析表明WT沙门氏菌激活STAT3的磷酸化，而ΔSPI1/2突变体不能，这些结果确定了STAT3信号是胞内S.Typhimurium感染的中心宿主靶标。
为了研究沙门氏菌激活STAT3对人类肠道环境的影响，作者利用CRISPR/Cas9构建了STAT3敲除的Caco-2IEC细胞系进行实验。与预期相符，沙门氏菌感染的IECΔSTAT3中缺失SOCS3，FGA和FGB。在上皮组织中，与WTIECs相比，IECΔSTAT3构建的组织模型中IL-6水平显著降低，但IL-8水平不变。与此相反，与WT沙门氏菌感染时的水平相比，感染ΔSPI1/2突变体的IECΔSTAT3IL-6和IL-8的水平都明显降低。这些结果表明，在上皮细胞中沙门氏菌依赖T3SS提高胞外IL-6和IL-8水平。然而，只有IL-6的诱导依赖于沙门氏菌引发的STAT3磷酸化，而IL-8似乎通过不同的机制。为了确定T3SS依赖性细胞因子的产生是局部沙门氏菌毒力策略还是扩散到血管，基底外侧IL-6和IL-8水平也进行了检测。顶部感染模型的血管部IL-6和IL-8水平显著升高。值得注意的是，它们的诱导在很大程度上不依赖于上皮细胞中STAT3等位基因和沙门氏菌的SPI1和SPI2毒力基因簇的存在。这揭示了沙门氏菌对人类宿主促炎反应的高度局部控制，与受感染小鼠的情况不同，沙门氏菌仍然局限于肠道内。
总之，在本研究中作者创建了一个3D肠道组织模型以研究人类肠道感染的细节。沙门氏菌感染后，该模型模拟了人类肠胃炎，将病原体限制在上皮间室，所以该模型优于现有的小鼠模型。在沙门氏菌感染模型中DualRNA-seq揭示了上皮细胞、内皮细胞、单核细胞和NK细胞之间以及与病原体之间的信号通路。结果表明，沙门氏菌利用其III型分泌系统来调控局部上皮组织中STAT3依赖性炎症反应，但不引起内皮细胞的改变。这个方法有望揭示人类对沙门氏菌和其他病原感染的特异性策略。
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