金梅林等：流感感染导致内源性动物双歧杆菌肠道种群的扩张，从而保护小鼠免受感染

供稿人：朱茜整理编辑：谢许茵

4月28日，国际学术期刊《GenomeBiology》在线发表了华中农业大学金梅林教授等合作团队的研究论文，题为“InfluenzainfectionelicitsanexpansionofgutpopulationofendogenousBifidobacteriumanimaliswhichprotectsmiceagainstinfection”，即“流感感染导致内源性动物双歧杆菌肠道种群的扩张，从而保护小鼠免受感染”。该文献利用半数致死量（LD50）现象和宏基因组测序分析来识别特定的抗流感肠道微生物并分析其潜在机制。研究表明，流感感染的严重程度与肠道菌群的异质反应密切相关。证明了动物双歧杆菌的抗流感作用，并且还发现致死性流感感染可导致内源性动物双歧杆菌的肠道种群扩展以增强宿主对流感的抵抗力，这代表了一种宿主与肠道菌群之间的新型相互作用。其数据表明双歧杆菌在预防流感和作为流感的预后判断方面具有潜在的实用性。

论文ID

标题：InfluenzainfectionelicitsanexpansionofgutpopulationofendogenousBifidobacteriumanimaliswhichprotectsmiceagainstinfection

期刊：GenomeBiology

IF:14.

发表时间：-04-28

通讯作者：金梅林，陈玲玲，刘辰

Doi:10./s--07-1

关键词：流感，肠道菌群，异质反应，LD50，动物双歧杆菌，抗流感效果，预后预测因子

背景

维持与肠道菌群的互利共生关系对人类健康至关重要。破坏这种关系会促进甚至直接导致多种疾病和功能障碍。尽管已经有文献报道了多种肠道微生物群保护宿主抵抗肠道感染的机制，但尚未完全阐明肠道微生物群防止肠外感染的机制，特别是在呼吸道中的机制。

流感是一种急性传染性呼吸道疾病，严重威胁着人类健康与生命安全。每年，流感流行影响近10亿人，其中包括至万例严重病例，多达50万死亡病例。H7N9也是流感病毒之一，自年以来，它偶尔会在中国大陆，香港，澳门和台湾引起流行性暴发。研究发现，肠道菌群在保护宿主免受流感病毒感染方面起着重要作用，并证实了几种新颖的保护机制。尽管如此，关于肠道菌群的抗流感作用的机理细节仍然未知。

结果

1.病死或幸存的流感感染小鼠的临床体征和肺部组织病理学损伤存在差异

为了评估宿主对流感的反应的异质性，该研究使用LD50方法用强毒（GX）和减毒（HB）H7N9病毒感染了特定的无病原体（SPF）C57BL/6小鼠，分别为强毒组（GX组）和减毒组（HB），另外施用磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照组（NC组）。GX组的所有小鼠均表现出明显的感染临床迹象，生存率为53.3％（16/30）。相比之下，NC和HB组中的所有小鼠均存活并且没有明显的感染症状（图1A）。根据小鼠是否死于感染，将GX组中的小鼠分别分为死亡组（n=14，GX.DG）和存活组（n=16，GX.SG）。小鼠体重的百分数曲线显示，GX.DG组的小鼠比GX.SG组的小鼠体重减轻更多（图1B）。进行重复实验以评估GX.DG和GX.SG组之间的差异，尸检和组织学检查均显示GX.DG小鼠的肺部病变明显比GX.SG小鼠的肺部病变更严重（图1C和附图S1）。这些发现表明，在相同剂量的流感病毒中死于或幸免于感染的小鼠具有明显不同的临床体征和明显的组织病理学差异，代表对感染的异质反应，并证实了LD50方法可用于区分个体对感染的特异性反应。

2.从幸存的强力流感病毒感染的小鼠中转移粪便微生物群，增加了受体小鼠对流感的抵抗力

对进行了粪便菌群移植（FMT）（图1D）,评估了在致死性感染中死亡或幸存的小鼠转移的粪便微生物群对受体小鼠中GX病毒感染的影响。与未感染小鼠（NC供体）或PBS处理小鼠的粪便微生物群移植小鼠相比，在感染后第3天或第9天从GX.SG小鼠收集的粪便微生物群的FMT显著提高了受体小鼠对流感病毒感染的存活率（图1E、F）。这些发现表明，在感染中幸存下来的小鼠粪便微生物群可能含有提供针对流感的保护作用的特定肠道微生物。

图1小鼠对流感感染的异质性与肠道菌群密切相关

3.肠道菌群根据流感感染的严重程度表现出明显的差异性

为了鉴定在感染后幸存的小鼠的抗流感肠道微生物，该研究在实验持续的16天之内，使用16SrRNA基因测序每天分析小鼠的粪便微生物群。将16天分为4个阶段：第1阶段（第0天），控制阶段；第二阶段（第1-4天），稳定阶段；第3阶段（第5-8天），减重阶段；和第4阶段（第9-15天），死亡阶段。Shannon多样性指数分析表明，在GX.DG小鼠中，细菌群落的丰度和多样性在第4阶段呈下降趋势，而在GX.SG，HB或NC小鼠中则没有（附图S2）。组间分析显示了相似的结果：在最后一个感染阶段的样本聚类表明，GX.DG组与其他三个组之间存在差异（附图S3）。

对肠道菌群的详细门类分类学分析显示，感染了GX株的小鼠，尤其是GX.DG小鼠，其肠道菌群中细菌分类学组成发生了明显变化（图2B）。在GX.DG和GX.SG组中，几个菌门表现出相似的变化趋势，两组间也存在一些明显的差异(图2C和附图S4)。这些结果表明，用强毒的H7N9毒株感染显著改变了肠道菌群的组成，在感染组与未感染组以及死亡组与存活组之间存在明显差异。通过进一步在属水平上进行分类学分析，根据肠道微生物的丰度与被感染小鼠健康状况之间的相关性，推测Lachnospiraceae_NK4A_group，Parassutterella，Lactobacillus和Bifidobacterium可能在宿主抵抗流感感染中起重要作用（图2D和附图S5）。

图2流感病毒感染会在单个小鼠中不同程度地改变肠道菌群

4.假双歧杆菌（Bifidobacteriumpseudolongum）和动物双歧杆菌（Bifidobacteriumanimalis）与流感感染小鼠的生存能力密切相关

继续在种水平上分析细菌，利用宏基因组测序分析代表性样品。通过稀疏性分析进行基因富集表征。估计的基因丰富度值几乎在所有组中都接近饱和，表明测序数据具有足够的覆盖范围(附图S6)。PCoA分析的结果表明，在感染后期，GX.DG样品中肠道菌群组成发生了显著变化（图3A）。继而分析所有基因的共丰度基因集合（CAG），以发现物种丰度与宿主健康状况之间的任何相关性，四个小鼠组别中带注释的CAG的相对丰度如图3B所示。富含CAG的Spearman相关网络比较分析发现，B.animalis（2CAG）和Clostridiumsp.（2CAG）与上述相关网络共有（图3C，D）。使用随机森林分类器对GX.SG和GX.DG组进行分类。Tenfoldcross-validation十倍交叉验证重复五次，结果表明该模型可预测感染小鼠的预后/严重程度（图3E）。分析证实了被感染小鼠的生存能力与特定细菌，特别是B.pseudolongum,Lactobacillus,andB.animalis之间密切相关。

进行LEfSe分析以获得每个时间点肠道菌群的详细差异（图3G，H和附图S7），利用qRT-PCR验证宏基因组学分析（附图S8），结果表明，GX.DG和GX.SG组之间的假长双歧杆菌和动物双歧杆菌的丰度变化与这些小鼠对流感病毒感染的差异反应有关，而不是源于这些肠道微生物初始丰度的差异。

基于因果关系上的客观因果关系法则，并根据FMT实验和GX.SG组中肠道菌群的分布特征，研究者推测肠道菌群会增加宿主小鼠的抗病性是通过增加B.pseudolongum或/和B.animalis的丰度实现的。

图3感染小鼠的生存能力与几种细菌种类的丰富紧密相关

5.大量与生存相关的微生物可以保护宿主免受流感的侵袭

抗生素溶液（ATB）处理SPF小鼠[18]，然后在感染之前通过管饲法接种两种细菌菌株B.pseudolongum和B.animalis（单株或组合）。结果显示，单独施用B.animalis或两种细菌的组合口服可显著提高受体小鼠的存活率，但单独用B.pseudolongum进行管饲则无明显效果（图4A），用两种细菌的组合管饲法处理的小鼠感染后，体重减轻在第6-10天明显改善，单独用动物双歧杆菌进行管饲法则体重减轻有所改善（图4B）。为了消除与ATB处理的小鼠相关的任何可能的假象，使用无菌小鼠重复实验，单独用B.animalis和两种细菌联合进行管饲，均可显著提高无菌小鼠的存活率，而单独给予B.animalis可提供与联合管饲法几乎相同的保护，ATB处理中只提供了一半（图4C）。结果表明，单独的B.animalis的移植提供了明显的针对流感的保护作用，并且可以通过在非无菌小鼠中额外施用B.pseudolongum来增强这种保护作用。

ATB预处理小鼠平行实验测定肺部病毒滴度和细胞因子水平及组织学检查。在感染后第3天和第5天，单用B.animalis或联用的小鼠的肺病毒滴度明显低于PBS处理的小鼠（图4D），细胞因子水平在两个时间点之间也显示出不同的趋势（图4E，附图S9）。数据表明，单用B.animalis或联用的小鼠与施用PBS的小鼠相比，较低的肺病毒滴度在H7N9感染的早期伴随着诱导更多的细胞因子。这表明动物双歧杆菌可能通过调节宿主的免疫反应来保护宿主免受流感感染。组织学检查显示单用B.animalis或联用的小鼠的肺部病变得到明显改善（图4F），进一步证实了动物双歧杆菌的抗流感作用。

图4口服与生存相关的微生物可保护受体免受强毒的H7N9病毒感染

6.动物双歧杆菌为肠道微生物组贡献特定的代谢功能，以保护宿主免受流感感染

对GX.SG和GX.DG或NC组之间的肠道微生物组进行了功能性元基因组比较。与GX.DG或NC组相比，GX.SG组增加了个KEGGOrthology（KO）项，它们每个时间点的分布特性如图5A所示，表明GX.SG组的肠道菌群的功能结构与NC组的更为相似。GX.SG和GX.DG组之间以及GX.SG和NC组之间的比较揭示了GX.SG组中丰富的代谢途径，显示出与KO项分析相似的分布特征（附图S10）。在感染后的第2天和第5天，与GX.DG和NC组相比，GX.SG组中的许多KO项都丰富了（图5A），意味着这些KO项非常可能在预防流感中起重要作用。与GX.DG或NC小鼠相比，感染后2天的GX.SG小鼠中B.animalis显著富集，但感染后5天则没有（图3G，H和附图S7），表明B.animalis在感染后2天比5天提供更多的抗流感作用。分析感染后2天的双阳性富集的KO项的功能组成以及B.animalis对这些项/功能的贡献（图5B），结果表明，动物双歧杆菌可通过促进缬氨酸，异亮氨酸，赖氨酸和CoA的生物合成来介导针对流感的保护作用。

图5不同小鼠组中肠道微生物组的功能宏基因组学比较

7.口服缬氨酸或腹膜内注射CoA可保护宿主抵抗流感

对ATB预处理的小鼠进行了缬氨酸，异亮氨酸或赖氨酸的灌胃，或腹膜内注射了CoA，然后鼻内注射了H7N9病毒。口服缬氨酸或腹膜内注射CoA可以显著提高受体小鼠的存活率并改善体重减轻，而赖氨酸的口服仅改善体重减轻，而异亮氨酸的口服没有作用(图6A，B，F，G)。但在体外，缬氨酸和CoA在A细胞中均未表现出明显的抗流感作用（附图S11）.表明口服缬氨酸或腹膜内注射CoA可在体内发挥抗流感作用，而这种作用可能是间接的。进行了平行动物实验，收集肺以确定病毒滴度，细胞因子水平和组织学变化（图6C–E，H–J），表明缬氨酸的抗流感作用可能是由于其在流感感染后的免疫调节特性，而CoA的抗流感作用可能是因为预先刺激了先天免疫应答。

图6口服缬氨酸或腹膜内注射CoA可保护受体小鼠免受强毒H7N9病毒感染

结论

成功地捕捉到小鼠模型中对流感病毒感染的异质性。确定动物双歧杆菌作为肠道微生物群的成员，可对流感病毒感染起到保护作用，证明了内源性动物双歧杆菌的肠道菌种群在流感感染后变得更加丰富，从而保护了宿主免受感染。说明了肠道菌群能够通过宿主与肠道菌群之间的新相互作用来保护宿主免受肠外感染。该研究还建立了使用肠道菌群作为预测流感患者严重程度和死亡率的新型生物标志物的潜力，可能有助于将来开发关于流感的精准医学策略。

附图S1肺部病变

附图S2

附图S3

附图S4

附图S5

附图S6

附图S7

附图S8

附图S9

附图S10

附图S11