前言

中枢神经系统（CNS）感染在新生儿中具有较高的发病率和死亡率，但传统的检测方法耗时且灵敏度较低。一些罕见的遗传病可能具有与中枢神经系统感染相似的临床表现，如癫痫、昏迷、肌张力障碍等。因此，本研究进行了一项前瞻性研究，旨在评估宏基因组二代测序（mNGS）在诊断新生儿CNS感染中的作用，并结合全外显子组测序(WES)探讨新生儿疑似CNS感染的病原学。

研究设计

招募了年9月1日至年5月31日期间在中国医院NICU住院的所有疑似CNS感染的新生儿。脑脊液同时送去做mNGS和常规检查，包括常规脑脊液和生化检查、培养、涂片和单纯疱疹病毒聚合酶链反应(HSV-PCR)。对仅使用mNGS鉴定的病原体的阳性试验进行正交确认试验。

在本研究中，病原学诊断为明确的脑膜炎，临床诊断包括疑似脑膜炎、病因不明的无菌性脑膜炎和可能的脑膜炎。对于所有确诊CNS感染（包括临床诊断和病原学诊断）的患者和临床诊断不明确的患者，进行WES，以明确具有类似CNS感染症状的疾病是否可能由其他基因缺陷引起，从而指导临床干预和策略。

相关定义：

脑脊液细胞增多症定义为脑脊液白细胞计数为≥20/mm3(0~28日龄)或5/mm3(年龄较大的儿童)。

明确的脑膜炎定义为(1)脑脊液中存在病原体或(2)脑脊液多胞症伴随血液中存在相关病原体或可选的阳性诊断试验。

疑似脑膜炎是脑脊液细胞增多症，并在无菌部位(血液除外)检测到相关病原体，出院诊断为脑膜炎。

原因不明的无菌性脑膜炎定义为脑脊液多胞症，但未发现病原体。

可能的脑膜炎定义为未经微生物学证实，但出院诊断为脑膜炎。

研究结果

总体特征在这项研究中，名患者接受了筛查和前瞻性登记。11名患者的父母拒绝腰椎穿刺，3名患者有血性脑脊液；该14名患者随后都被排除在外。共招募了88名患者，收集了份脑脊液样本(图1)。剖宫产占44.3%(39/88)。入院时的中位年龄(54.5%为男性)为10天(31天)，胎龄中位数为38±1周(6周)，出生体重为g(g)(表1)。

图1

研究流程图。

表1

纳入患者的基线特征。

mNGS的总体诊断性能

份脑脊液标本中，常规方法阳性率为4.95%(5/)，mNGS阳性率为19.8%(20/)(图2A、B)。在5%(1/20)的mNGS阳性样本中观察到多重感染，而常规方法检测不到这些感染。如图2C所示，与常规方法相比，mNGS的敏感性为%(5/5)，特异性为84.4%(81/96)，阳性预测值为25%，阴性预测值为%。

mNGS可实现更广泛的病原体种类检测。在20份阳性样本中，mNGS检测到11种微生物，包括8种细菌和3种病毒。mNGS观察到中枢神经系统感染的罕见病原体（人型支原体）。传统方法仅检测到四种微生物，包括1种大肠杆菌、1种表皮葡萄球菌、1种HSV-1和2种HSV-2。鉴定出的前三位病原体是大肠杆菌、表皮葡萄球菌和巨细胞病毒(图2A、B)。

图2

(A)mNGS与常规检测结果；(B)mNGS与常规检测确定的病原体分布；(C)mNGS与常规方法的比较；(D)不同方法在两个组中的检出率。经验性治疗组mNGS检出率明显高于常规方法，尤其是细菌感染。mNGS在已经接受过抗生素治疗的新生儿中具有更为明显的优势。在CSF取样之前，分别有62.4%(63/)和37.6%(38/)的患者接受了经验性治疗或未经验性治疗。样品分为两组，在经验治疗组中，mNGS的检出率明显高于常规方法[27%(17/63)vs6.3%(4/63)，p=0.]。在未经验性治疗中，mNGS和常规方法的检出率分别为5.3%(2/38)和2.6%(1/38)。无论在经验性治疗组，还是未经验性治疗中，mNGS检测细菌CNS感染的检出率均显著高于培养（分别为17.5%vs1.6%,p=0.;5.3%vs2.6%）（图2D）。WES基因测试脑脊液mNGS和血液WES联合用于确定新生儿疑似中枢神经系统感染的病因。根据我们的诊断流程图，43例患者进行了WES检查。最终，使用WES发现6名患者有遗传病因。除感染症状外，6名患者中有5名出现癫痫发作或其他神经系统异常。患者C4的母亲在分娩前发烧，孩子在出生后出现癫痫和发烧；然而，脑脊液检测结果均为阴性，最终被确认为由于KCNQ3突变而在新生儿期开始癫痫发作。患者C43有严重的代谢性酸中毒、癫痫发作和不适。他的脑脊液检查也呈阴性，最终被诊断为精氨酸琥珀酸尿症。患者C87在入院前脑脊液中检测到多重无乳链球菌感染，血液中检测到CMV，基因检测证实患有原发性免疫缺陷病（PID）（表2）。

表2

有明确基因诊断的6名患者。

对临床治疗的影响

mNGS诊断可指导新生儿中枢神经系统感染的临床治疗。88例患者中有16例被病原学诊断为中枢神经系统感染。在这16例患者中，3例同时经mNGS和常规检查确诊，13例(14.8%)单独经mNGS确诊。仅基于mNGS的13例诊断中有12例可能有临床效果(一名患者的父母停止治疗)，13例中有9例改变了抗生素治疗。基于mNGS的临床治疗管理分为两类。首先，mNGS结果支持治疗，例如，在患者C60中，临床医生经验性地选择了美罗培南，然后继续使用，直到患者痊愈。其次，根据mNGS确定的病原体对治疗方案进行改进，如mNGS在患者c74中检测到大肠埃希菌和CMV的多重感染后加用更昔洛韦。在患者C80中检测到人型支原体，临床医生根据mNGS结果加用阿奇霉素，体温和脑脊液白细胞/蛋白比值均降低(表3)。

表3

基于mNGS结果的16名患者的临床管理。

根据mNGS半定量测序结果调整抗生素疗程。由于疾病的需要，9名患者在住院期间接受了两次以上的mNGS检测，以观察mNGS的动态监测效果。在患者接受有效的抗菌治疗后，mNGS测序读数减少，甚至变为阴性，而脑脊液参数(包括白细胞计数以及蛋白质和葡萄糖水平)与治疗没有显示出一致的相关性(图3)。在患者C25中，连续两次读数为阴性。虽然患者仍有脑积水，脑脊液蛋白水平较高，但排除了感染因素，及时停用抗生素。

图3

mNGS在CNS感染动态监测中的半定量值。病例1是表皮葡萄球菌；病例2是大肠杆菌和巨细胞病毒；案例3是HSV-2；病例4为无乳链球菌；病例5为大肠杆菌；病例6为巨细胞病毒；病例7和9尽管检测到读数，但被诊断为污染；病例8为阴性。

研究讨论

1）mNGS对新生儿中枢神经系统感染具有良好的诊断性能；

2）在感染性疾病的早期，mNGS受抗生素的影响较小，更适合新生儿；

3）临床指导是评价mNGS临床有效性的关键；

4）脑脊液mNGS和WES联合检测有助于确诊新生儿疑似中枢神经系统感染。

研究结论

脑脊液mNGS的使用有可能克服传统CNS感染诊断的一些局限性。mNGS对新生儿中枢神经系统感染具有良好的诊断性能，尤其是在使用经验性抗生素治疗后。对于中枢神经系统感染或临床病因不明的患者，应及时完成WES，以便对患有遗传病的新生儿进行早期检测，并指导遗传咨询和临床策略。

参考文献

GeM,GanM,YanK,etal.Combiningmetagenomicsequencingwithwholeexomesequencingtooptimizeclinicalstrategiesinneonateswithasuspectedcentralnervoussysteminfection[J].Frontiersincellularandinfectionmicrobiology,,11.

END

南京诺因生物科技有限公司

南京诺因生物科技有限公司总部坐落于江苏省南京市，专注应用领先的基因技术助力临床感染病原的诊疗。公司围绕多重PCR和高通量测序两大前沿技术路线，自主研发了应用于常见病原快速检测和急危重症感染全面检测的一系列解决方案，已与国内众多一流的医学机构展开了紧密合作，打造基于大数据的人工智能诊断系统和服务。公司将秉承"创新"和"利他"的理念，引领病原感染诊断事业进入新时代，为病原精准诊断领域带来更多突破。

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