李鸿茹简介：医学博士，医院呼吸与危重症医学科副主任医师，内科教研室教学秘书，中国医药教育协会肺癌专委会青年委员。临床工作10余年，主要擅长肺部感染病原诊断及肺癌的靶向及精准治疗。目前主持省厅级课题3项，院内优秀青年课题1项。参与国家重大专项“十二五”“十三五”课题及“”课题，并参与其他国家级课题7项，参与省厅级课题十余项。共发表论文SCI论文9篇（第一作者4篇），以第一作者在国家级期刊以上发表10余篇。获全国中青年呼吸医师论坛优秀论文奖1次，全国呼吸年会优秀论文1次，广东省医学会第十八次呼吸病学学术会议暨岭南论坛三等奖1项。以第二完成人获福建省科学技术三等奖1项，福建省医学科技二等奖1项，获福建省自然科学优秀论文2次。

肺部感染是常见病，多发病，在我国为各种疾病死亡原因第五位，医疗和社会负担沉重。临床诊疗过程中，肺部感染病程迁延、并发症多、病原学循证资料有限，造成抗生素的滥用、治疗过度及治疗不足，所以提高肺部感染病原体检出率、增加病原学检测的准确性和可靠性具有重要意义。肺部感染病原诊断的主要检测方法包括病原体分离和培养、抗原检测、抗体检测和分子生物学方法等。分子生物学方法具有敏感性高、特异性高、检测快速的优点，并且随着诊断技术向着“高、精、集成”和“简单、便捷、个人健康管理”的趋势发展，新的诊断技术尤其生物芯片技术及核酸检测床边病原诊断技术在临床上的应用及推广具有很大前景。本文主要介绍上述几种病原检测方法及比较各种方法的优缺点，并重点介绍病原核酸检测的研究进展及应用。

肺部感染；病原体的分离和培养；免疫学检测；分子生物学方法；核酸检测

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1我国呼吸道感染的现状

目前呼吸道感染居我国各类感染首位，除外爆发流行时期病例，急性呼吸道感染仍高居门诊就诊数、住院数首位，其中肺炎发病率高，在各种致死病因中居前5位，为我国5岁以下儿童的发病数及死亡数的疾病之首，也是我国65岁以上老年人疾病死亡数最多的疾病[1]。肺部感染医疗和社会负担沉重，其诊治的关键在于病原学诊断及早期精准治疗。但引起肺部感染的病原体种类繁多，有细菌、非典型病原体、病毒，还有真菌、结核及其他致病菌。这些病原体引起的肺部感染在临床表现上特异性有限，故病原学及时检测特别重要，但不同检测方法具有存在敏感性、特异性、便捷性、可重复性、检测速度等方面的特点，本文对肺部感染病原诊断研究进展。

2呼吸道病原诊断主要检测方法

肺部感染病原诊断的主要传统检测方法包括病原体分离和培养、免疫学检测和分子生物学方法等。

2.1常见病原体的分离和培养

传统的培养方法可检测病毒、细菌、非典型致病菌、真菌等各种致病菌，临床应用最广的属细菌和真菌的培养。细菌培养是指将标本接种于培养基上（培养基常用牛肉汤、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、血液等和某些细菌所需的特殊物质配制成液体、半固体、固体等状态）做分离培养，然后进一步对所得单个菌落进行形态、生化及血清学反应鉴定，目前多采用血平板培养链球菌及苛养菌，巧克力平板培养流感嗜血杆菌及需氧菌。真菌需使用改良马丁培养基或沙保罗培养基以提供真菌生长所需的营养成分来进行培养，然后进行菌落鉴定，目前临床上多采用微生物自动鉴定仪对菌种进行鉴定。传统培养不但可以鉴定细菌，也可检测细菌的药敏情况，而且病原体培养特异性非常高，被认为是分离和鉴定病原体的“金标准”[2]。但病原体培养通常耗时长、检出率低，所取标本好坏可严重影响检出率，且受抗生素影响很大，临床应用存在一定局限性。

致病菌培养要求高，较难开展。军团菌为革兰阴性杆菌，专性需氧，为胞内寄生菌。军团菌最初是从以军团菌患者肺组织感染的豚鼠中分离出来的，这种方法非常昂贵，且费时费力，不久就被平板培养法所取代[3]，目前标准培养基为活性碳酵母浸膏琼脂平板，即军团菌生长平板（BCYE）。接种在BCYE平板上，在浓度为2.5%CO2的环境下，温度为35～37oC，培养10d，可见军团菌菌落生长。军团菌的菌落通常呈白色、灰色、有荧光，军团菌在BCYE平板上生长而在半胱氨酸缺失BCYE-Cys平板上不生长可有助鉴别该菌。支原体（MP）是年发现的一种类似细菌但不具有细胞壁的原核微生物，营养要求比细菌高，除基础营养物质外，还需加入10%～20%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇，最适pH7.8～8.0，低于7.0容易死亡。大多数支原体兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入5%CO2生长更好，但该病原体生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育2～3d可出现典型的“荷包蛋样”菌落，传统培养较困难，临床很难开展，目前应用较广的是MP的快速液体培养法，该法为利用MP生长代谢产物可使培养基液体中指示剂颜色发生改变的现象来判断其生长情况[4]。病毒培养需在细胞内进行，将咽拭子标本接种猴肾细胞（I.I.C—MK2）、犬肾细胞（MDCK）、非洲绿猴肾细胞（VeroE6）、人胚肺成纤维细胞（MRC-5）、人鼻咽癌细胞（HEp-2）等细胞，经短期增殖，在细胞发生病变前，用血细胞吸附或血凝试验方法进行筛选后，以单克隆荧光抗体检测病毒复制早期产生的相关蛋白来确定病毒种类，平均周期约为2～3d[5]。非典型致病菌的培养条件较复杂，病毒则只能在活细胞内生长繁殖，细胞内培养要求条件高、技术难度高，一般医疗场所难以开展该检测，且检测时间也较长，限制其在临床中的应用。

病原体的分离和培养是肺部感染病原诊断的金标准，特异性高，但病原体培养条件要求高，耗费时间长，敏感性低，标本中病原体量少，易致假阴性，不适用于肺部感染早期病原学筛查及治疗。

2.2免疫学检测方法

免疫学检测是利用抗原、抗体特异性结合的基本原理测定血液中病原体相关抗原或机体针对病原体反应产生的抗体的方法，包括凝集试验、补体结合试验等。除了传统的血清学检测方法外，标记免疫测定（如酶联免疫测定、放射免疫测定、免疫荧光测定等）目前也被广泛使用。

直接免疫荧光法可快速（24h）从临床标本中检测病原体抗原获得检测结果，即使已经应用抗生素治疗的患者仍可检出病原菌[6]。用直接免疫荧光法检测嗜肺军团菌，特异性高达95%～%[7]，但其敏感性却仅有25%?75%[6]，且需专业人员操作[7]，由于交叉反应可能引起假阳性，因而在临床诊断中的应用价值有限[8]。儿童CAP的病原学检查采用咽拭子间接免疫荧光法检测流感病毒（A、B型）、副流感病毒（1、2、3型）、腺病毒、呼吸道合胞病毒抗原具有一定的敏感度。另外，目前能同时检测嗜肺军团菌1型（LP1型）、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒9项病原体IgM抗体的间接免疫荧光试剂已在临床上广泛使用[9]。血清酶联免疫吸附法（ELLSA）检测肺炎支原体IgM、衣原体IgM、嗜肺军团菌IgM、柯萨奇病毒BIgM、巨细胞病毒IgM，乳胶凝集法检测EB病毒抗原，免疫金标法查EB病毒抗体等在临床已较普遍开展[10]。

免疫学检测为临床病原检测很有益的补充，抗原检测在感染出现症状后即可检测，可用于疾病早期诊断，多使用直接免疫荧光法，非特异性反应少，背景较低，但存在敏感性较差的缺点。抗体检测一般在感染1周后，有滞后性，但恢复期较急性期抗体滴度升高4倍以上具有确诊意义，抗体检测多使用酶联免疫反应或间接免疫荧光反应，敏感性较高，但存在非特异性荧光反应。

2.3分子生物学方法

相较于上述几种传统的病原体检测方法，分子生物学方法是近年来新兴但发展迅速的检测方法。核酸检测的主要技术有核酸分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、生物芯片技术[包括固相芯片（恒温扩增技术）及液相芯片技术]和基因测序等。

2.3.1核酸分子杂交技术

核酸分子杂交是具有一定互补序列和核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程。将待测核酸序列和探针序列杂交，可对待测核酸序列进行定性或定量检测，如Southernblot、Northernblot、原位杂交等。国外有报道提示核酸分子杂交技术对于肺部感染疑难病例的病原学诊断有一定帮助[11-12]。但该方法敏感性较差，多用于科研，在临床较难开展。近年来，在核酸分子杂交技术的基础上，结合PCR技术等衍生的基因芯片技术具有高通量、快速检测、高灵敏度及特异性等优点，可应用于肺部感染常见病原体的检测[13-14]及致病菌耐药基因的研究[15]。目前已研发应用于呼吸道病原体经检测的基因芯片，可用于检测化脓性链球菌、百日咳杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体以及9种呼吸道病毒（腺病毒4型，冠状病毒OC43、E、HK，流感病毒A、B型，副流感病毒1～3型，呼吸道合胞病毒）[13]。

2.3.2PCR技术

PCR技术以其特异、快速、敏感的特点成为肺部感染病原检测的一个重要方法（表1），尤其是在病毒核酸检测方面，较其他方法有明显优势[16]。PCR具有高敏感性、特异性及操作简便特点，大大弥补了临床病原分离及检测困难的缺陷，成为目前临床检测病毒的主要方法之一[16]。将各种病原扩增条件进行整合，可将不同病原菌放在同一个条件下进行PCR检测，即多重PCR检测，可高通量、多指标检测呼吸道病毒，目前国内外已有多重试剂盒上市用于不同病毒的检测。

2.3.3生物芯片技术

基因生物芯片技术利用荧光标记的DNA碱基在不同的波长下吸收和发射光，然后在微阵列中，通过多色荧光标记同时对两个或多个生物样品进行多重分析，从而可用于呼吸道病原高通量、多指标同时检测，且具有较高特异度、敏感度、可快速检测特点，为目前肺部感染病原筛查最有前景的方法之一，也是核酸检测床边诊断系统的主要方法和手段，主要包括固相芯片（恒温扩增技术）及液态芯片技术两种。

2.3.3.1恒温扩增技术

恒温扩增技术主要包括链置换扩增法（SDA）、核酸序列扩增法（NASBA）、转录介导扩增法（TMA）和滚环扩增法（RCA）以及环介导等温扩增法（LAMP）等。以LAMP为例，LAMP是Notomi等[17]在年开发的一种恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶（BstDNApolymerase）在等温条件（65℃左右）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程[18-19]。LAMP灵敏度高、特异性好，且操作简便、快速，许多研究用于不同病原的检测，效果较好[20-22]。医院高占成教授带领的团队所研发的环介导等温技术（LAMP）可同时快速筛查13种病原（肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌复合群），该方法已证实具有较强的特异度及敏感度，并在年下半月正式上市[23]。目前我院呼吸科已开展此技术进行床边快速病原诊断，且临床效果良好[18]。

2.3.3.2液态芯片技术

液态芯片技术是把直径为5.6μm的聚苯乙烯小球用荧光染色的方法进行编码，通过调节两种荧光染料的不同配比获得最多可达种具有不同特征荧光谱的微球，然后将每种编码微球共价交联上针对特定检测物的抗原、抗体或核酸探针等捕获分子，加入待检样本后，在液相条件下，靶分子与微球表面交联的捕获分子发生特异性结合，在一个反应孔内可以同时完成多达种不同的检测反应，然后通过激光检测、数字信号处理器等技术，可以实现快速、高通量、多指标、同步定量检测多种病原的目标，是目前最有潜力用于呼吸道病原筛查的方法之一。其中国外luminex公司研发x-Tag的呼吸道病毒试剂盒已上市，该试剂盒能同时检测18种目标病毒（甲型流感H1N1，季节性流感H1N1，季节性流感H3N2，流感病毒A型和B型，呼吸道合胞病毒A，呼吸道合胞病毒B，人偏肺病毒，腺病毒，鼻病毒/肠病毒，副流感病毒1型、2型、3型、4型，冠状病毒E，冠状病毒OC43，冠状病毒HKU1，冠状病毒NL63）[24]。

另外，由本单位呼吸研究室自主研发的液态芯片检测系统可同时检测细菌、非典型病原体及病毒等多种病原，目前已证实在3～6h内可同时检测96份标本的20种病原，包括12种病毒：人巨细胞病毒、腺病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、SARS冠状病毒、甲型流感病毒、人感高致病禽流感病毒（H5型）、人感高致病禽流感病毒（N1型）、人偏肺病毒和人博卡病毒；2种非典型致病菌：肺炎支原体和肺炎衣原体；6种细菌：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌，初步验证具有较高敏感度及特异度，该方法实现快速高通量多指标同步检测并覆盖多种病原，这是目前开发的较早能同时检测包括细菌、病毒和非典型致病菌在内的多种病原的高通量筛查系统之一，有望今后成为呼吸道传染性疾病病原筛查系统之一[25]。

2.3.4基因测序

包括常规基因测序及宏基因测序，经过培养发现新的病原可经过全基因测序了解病原的序列并与基因库比对了解病原的种属，主要应用于未知病原的鉴定，但费用较高，临床难以常规开展。另外下呼吸道分泌物宏基因组测序有助于了解下呼吸道微生物状态及致病病原，随着二代测序技术的发展及成本的下降，宏基因组测序在下呼吸道感染的作用越来越凸显，尤其是在早期快速病原筛查阴性及病情急危重及疑难病例感染中发挥越来越重要的作用。但该方法目前进入临床时间不长，各种菌株库的建立不完善，且宏基因测序结果可能出现多种病菌，存在难以判断定植菌及致病菌等情况，需与临床紧密结合方能较好地发挥检测病原的作用[26]。宏基因组测序主要可利用不同病原体16SrRNA进行，16SrRNA编码基因内部结构由可变区和保守区组成，保守区为所有病原菌共有，可变区具有种属特异性，可根据保守区设计各种病原菌的通用引物。依据这些特征通过通用引物对各种病原的16SrRNA基因扩增，测定扩增产物的序列，进行序列对比，从而鉴定细菌的种类[8，26]。16SrDNA测序不受抗菌药物治疗影响，亦不需要体外培养，可直接检测，缩短检测时间，具有快速、高效、准确、特异性强的优点[8]。基因测序还能够应用于顽固耐药菌的耐药基因检测与分子流行病学特征研究，如耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌KPC基因检测，为研究细菌耐药提供参考依据，对院感尤其是重症病房、急诊病房呼吸道感染的防控及抗病原治疗具有重要指导意义[27-28]。

3床边病原诊断系统（POCT）

近年来，诊断技术发展趋势一种是向着更“高、精、集成”的方向发展；另一种是向着“简单、便捷、个人健康管理”的方向发展。在这样的背景下，生物芯片技术及核酸检测POCT产品等应运而生。通过将各种核酸检测技术及步骤“浓缩”成一个个微小“模块”，如同电子芯片一样，将这些“模块”进行组合并“集成”在一个平台上，实现核酸检测的提取、扩增、信号放大及转导、信号检测等基本步骤的一体化。例如，就像介于输入信息与输出结果之间的计算机运算程序，核酸电路对输入的靶序列进行扩增、信号转导及检测等一系列“运算”过程，以荧光、电化学、显色反应信号的形式输出结果，从而实现对靶序列的定性、定量检测（图1）。简化了核酸检测流程，操作简单，反应时间缩短，易于标准化测定，提高了核酸检测的灵敏度及特异性，成为核酸检测POCT产品的主要原理。第三代核酸检测将核酸提取扩增检测均结合在微流控的核酸电路中，在密闭系统里面一次性完成，减少了外周环境的干扰，同时更加自动便捷的将核酸检测的所有流程一体化进行，使床边病原诊断成为可能[29]。

随着材料技术的发展，床边诊断由显色的纳米微粒到荧光标记技术，到微流控技术，发展到目前最前沿的基于光学检测的POCT技术（图1），床边病原诊断的特异度、时效性及便捷性在不断提高，其临床标本检测时间逐渐缩短至半小时之内，有望实现真正的床边快速诊断。

注：将带有反应、保温、混合功能的膜、泵、管道等部件小型化并集成到一个塑料的芯片上；样本裂解、核算分离、扩增和检测的荧光PCR在一个卡片上完成；工作时由配套的机器完成液体流动及阀门的开合，无需人工参与。

4小结

总之，肺部感染病原诊断有助于早期发现病原体并有针对性地进行“精准”治疗，控制病情进展，缩短病程，提高治愈率，避免抗生素的滥用，减轻患者的负担。目前针对肺部感染病原诊断的检测方法多种多样，近年来迅速发展的基于分子生物学技术的检测方法具有灵敏度高、特异性好、检测迅速、易于标准化的优点，在病原学诊断方面应用前景广阔。另外，以“高、精、集成”以及“简单、便捷、快速、高通量”为特点的生物芯片技术及核酸检测POCT产品特别受到瞩目，将为临床床边早期病原诊断方法带来重大的革新。

参考文献（略）

文章来源：《福建医药杂志》年呼吸疾病增刊

作者：何华强李鸿茹（通信作者）

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为建立和谐的医患关系，推动医学人文发展,《福建医药杂志》自年开始，新设置“叙事医学”栏目。对该栏目优质来稿，本刊将优先发表，并在

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